Angela OSTUNI | BIOTECNOLOGIE MEDICO DIAGNOSTICHE AVANZATE

ITALIANO

Conoscenza e comprensione Il corso si propone di fornire gli strumenti per conoscere e saper utilizzare tecniche di biologia molecolare nell’ambito della diagnostica clinica

Capacità di applicare conoscenza e comprensione Lo studente acquisirà le conoscenze per scoprire condizioni normali e patologiche, identificare alterazioni biomolecolari qualitative e quantitative, monitorare il decorso di una patologia, monitorare l’efficienza di una terapia mediante tecniche di diagnostica molecolare

Autonomia di giudizio, abilità comunicative, capacità di apprendimento Lo studente sarà in grado: di valutare criticamente e autonomamente l’impiego delle metodologie utilizzate in ambito diagnostico; di utilizzare un linguaggio chiaro, preciso e scientificamente corretto. Lo studente sarà in grado di progettare ed eseguire un protocollo sperimentale, di interpretare dati e di scrivere una relazione.

Gli studenti devono aver acquisito conoscenze di citogenetica

Estrazione e valutazione della qualità degli acidi nucleici; sintesi chimica e controllo di qualità di oligonucleotidi; preparazione di sonde per saggi di ibridazione; sistemi array; analisi di espressione genica mediante real time PCR; analisi di polimorfismi e mutazioni; DHPLC; NGS; analisi dell’epigenoma; diagnosi prenatale

Blocco 1 (5 ore)

Variabilità delle misure e biologiche osservate in medicina di laboratorio. Controlli di qualità interni e valutazione esterna di qualità di un laboratorio clinico. Organizzazione del flusso di lavoro in un laboratorio di analisi molecolari. Vantaggi e limiti della diagnostica molecolare. Estrazione di acidi nucleici da campioni biologici per analisi molecolari. Estrattori automatici di acidi nucleici. Ottimizzazione dei metodi di estrazione degli acidi nucleici da tessuti e da campioni usati in indagini forensi Valutazione della qualità del DNA genomico. Estrazione di RNA; uso di acidi nucleici carrier; purificazione di miRNA.

Dosaggio di acidi nucleici mediante metodi spettrofotometrici e fluorimetrici. Valutazione della qualità del RNA: elettroforesi capillare microfluidica, tecnologia lab-on-a chip.

Blocco 2 (5 ore)

Sintesi chimica in fase solida di oligonucleotidi. Metodo del fosforoammidito. Gruppi protettori delle basi eterocicliche e dello zucchero. Scala di sintesi. Efficienza di accoppiamento. Sintesi di geni. Sintesi di oligonucleotidi degenerati. Oligo-LNA. Oligo-PNA. Oligo-modificati.

Purificazione oligonucleotidi: precipitazione, cromatografia su strato sottile, gel elettroforesi, HPLC a scambio anionico e fase inversa. Controllo di qualità degli oligonucleotidi mediante elettroforesi capillare, spettrometria di massa.

Blocco 3 (5 ore)

Progettazione di sonde genetiche. Sintesi di sonde a RNA. Marcatura delle sonde.

Saggi di ibridazione e applicazioni nella diagnostica medica. Fattori che influenzano le reazioni di ibridazione tra acidi nucleici. Concetto di stringenza. Saggi di ibridazione standard su fase solida: Southern blot, Dot e reverse blot con oligonucleotidi allele specifici (diagnosi anemia falciforme, fibrosi cistica). Ibridazione a sandwich. Ibridazione in soluzione e cattura: PCR-ELISA (genotipizzazione HPV)

Microbiologia clinica: branched DNA, NASBA, LCR.

Blocco 4 (4 ore)

Ibridazione in situ su tessuto. Tecniche di citogenetica molecolare per la rilevazione di aberrazioni numeriche e strutturali e riarrangiamenti criptici su cromosomi. Preparazione di campioni per FISH, preparazione delle sonde (ibridi somatici monocromosomici, microdissezione cromosomica, citometria a flusso); Multicolor FISH Spectral karyotyping imaging (SKY): principio ed applicazioni; CGH (comparative genomic hybridization): principio ed applicazioni

Blocco 5 (6 ore)

Ibridazione inversa su fase solida, immobilizzazione delle sonde: gli array. Marcatura dei target. Preparazione di chip ad oligonucleotidi: tecnologia Affimetrix. Array a cDNA. Microarray a DNA spottato. Analisi dei profili di espressione e dei polimorfismi. Estrapolazione significato biologico: clustering e significato diagnostico.

Protein arrays: principio, preparazione e applicazioni. Affibodies. Aptameri.

Tissue array: principio, preparazione, applicazioni

Applicazione degli array in ambito diagnostico, prognostico e terapeutico.

Blocco 6 (7 ore)

Principi della Real Time PCR. Applicazioni in ambito clinico. Strumentazione. Fluorofori intercalanti, SyBr green; analisi della curva di melting.

Sonde ad ibridazione. Design delle coppie sonda-primer. Sonde PNA e LNA. Sonde Taqman e FRET. Sonde conformazionali: beacon e scorpions. Analisi del profilo di espressione per comprendere i meccanismi molecolari di un fenotipo clinico patologico e individuare target farmacologici. Analisi dei dati. Real time PCR quantitativa assoluta e relativa. Valutazione della efficienza di amplificazione.

Diagnostica di infezioni virali, analisi quantitativa assoluta. SARS-CoV-2 Test Kit (Real-time PCR). Determinazione quantitativa di OGM mediante Real Time PCR.

Blocco 7 (7 ore)

Polimorfismi del DNA e applicazioni in ambito medico. Polimorfismi di restrizione, RFLP: diagnosi di anemia falciforme, talassemia, emofilia. Polimorfismi di lunghezza: VNTR, STR. Sindromi da espansione di triplette.

Polimorfismi del DNA mitocondriale. Polimorfismi del cromosoma Y

Polimorfismi a singolo nucleotide o mutazioni: analisi mediante oligonucleotidi allele specifici (ASO); sonde Taqman, Beacon e FRET; Tecnica SNuPE (estensione del primer); PCR-ARMS; saggio di ligazione degli oligonucleotidi (OLA). PCR-DGGE, PCR-SSCP.

Ricerca mutazioni mediante DHPLC: principio e applicazioni

Blocco 8 (5 ore)

Ricerca di mutazioni/polimorfismi mediante sequenziamento per interruzione di catena, arrayed primer extension (APEX). Next generation sequencing. Pirosequenziamento.

Metodologie di analisi dell’epigenoma: accessibilità della cromatina; modificazioni istoniche; sequenziamento di sRNA o lncRNA; metilazione del DNA.

Blocco 9 (4 ore)

Indicazioni alla diagnosi prenatale. Diagnosi pre-impianto: su globuli polari e blastomeri. Diagnosi prenatale post-impianto

Indagini invasive: villocentesi, amniocentesi, cordocentesi, fetoscopia.Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) per indagini di aneuploidie. cGH-array. Indagini non invasive: ecografia (età gestazionale; translucenza nucale; esame ossa nasali), Test su sangue materno: BI-TEST, TRI-TEST.

Ricerca DNA fetale e cellule fetali nel sangue materno.

Blocco 10 (24 ore)

-Progettazione e realizzazione in laboratorio di un esperimento di Real-time PCR finalizzato allo studio dell’espressione genica su cellule umane in coltura. Analisi e discussione dei risultati.

- Virtual lab su diverse tecniche avanzate di diagnostica molecolare

Il corso prevede 48 ore di lezione in aula e 24 ore di esercitazione in laboratorio per piccoli gruppi di studenti. Laboratorio virtuale in aula.

L’esame è orale. Lo studente deve dimostrare ragionamento critico e capacità di collegare i diversi argomenti affrontati.

- Linee guida sulla gestione dei programmi di controllo di qualità interno; Linee guida per la gestione di valutazione esterna di qualità

- Diagnostica Molecolare nella medicina di Laboratorio (Piccin)

-Sintesi di oligonucleotidi: https://www.mt.com/it/it/home/applications/L1_AutoChem_Applications/L2_ReactionAnalysis/oligonucleotide-synthesis.html

-Ibridizzazione in situ: https://www.youtube.com/watch?v=n6dN2pjCQuUhttps://www.youtube.com/watch?v=xeylG6kGIaA

https://www.youtube.com/watch?v=5f78t0AH5js

-Ibridazione di acidi nucleici: principi e applicazioni capitolo 7: http://static.zanichelli.it› a04.9788808059437.pdf

-Mauro Maccarrone: Metodologie biochimiche e biomolecolari. Strumenti e tecniche per il laboratorio del nuovo millennio (2019)(Zanichelli)

-medicalsystems.it/wp-content/uploads/2015/10/222_Applic-microar-1.pdf

- Dispense del corso o articoli scientifici (in inglese) di approfondimento su specifici argomenti forniti dalla docente

All’inizio del corso, vengono presentati agli studenti gli obiettivi del corso, il programma, i metodi di verifica e il materiale didattico disponibile. La docente farà l'elenco degli studenti, indicando nome, matricola ed e-mail. Entro il mese di novembre la docente prende l’elenco degli studenti che intendono seguire le esercitazioni di laboratorio. La partecipazione alla esercitazione è possibile solo su prenotazione.

Il ricevimento studenti è il venerdì dalle 16 alle 19 (2° piano del Dipartimento di Scienze) previo appuntamento via e-mail. La docente è disponibile anche ad appuntamenti su piattaforma meet, concordati via e-mail.

3 Febbraio, 3 marzo, 5 maggio, 7 luglio, 8 settembre, 13 ottobre, 11 dicembre

NO

Le date di esame possono essere consultate al seguente link

https://unibas.esse3.cineca.it/ListaAppelliOfferta.do;jsessionid=C48EC804020D99044C736AB9D737FF66.esse3-unibas-prod-04